一、水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)方法

獸藥殘留（animal drug residues）是指給動(dòng)物使用藥物后蓄積或貯存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的藥物原形、代謝產(chǎn)物和藥物雜質(zhì)。近10年來，水產(chǎn)品中獸藥殘留問題引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注，也經(jīng)歷了貿(mào)易壁壘的多發(fā)期，直接影響著中國(guó)水產(chǎn)行業(yè)的轉(zhuǎn)型和升級(jí)。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，非法使用違禁藥物、不遵守休藥期、生物體代謝差異和不合理用藥等都有可能導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)。

獸藥殘留分析的檢測(cè)手段多樣，酶聯(lián)免疫試劑盒、膠體金免疫試紙條和熒光試紙條等快速檢測(cè)產(chǎn)品能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、快速篩選，其靈敏度、準(zhǔn)確性和時(shí)效性正在不斷優(yōu)化和革新；氣相色譜儀、液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜儀、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和高分辨質(zhì)譜等儀器是實(shí)驗(yàn)室常用的分析設(shè)備，具有定量準(zhǔn)確、準(zhǔn)確度更高等優(yōu)點(diǎn)，特別是具有高靈敏度、高分辨率的質(zhì)譜儀，是進(jìn)行陽性樣品確證分析的首選。

1、硝基呋喃類代謝物檢測(cè)方法

硝基呋喃類藥物是一類化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，常見的有呋喃唑酮(furazolidone，F(xiàn)ZD)、呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion，NFT)和呋喃它酮(furaltadone，F(xiàn)TD)，曾廣泛用于畜禽、水產(chǎn)等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療。硝基呋喃類藥物原藥及其代謝產(chǎn)物具有一定的毒性，有致畸、致突變和致癌的危險(xiǎn)。出于安全性考慮，自1993年開始，歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)先后頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。中國(guó)于2002年頒布的農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》，明確禁止使用硝基呋喃類廣譜抗菌藥物。但是由于硝基呋喃類藥物價(jià)格低廉、療效好，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍存在違禁使用的現(xiàn)象，在近幾年開展的水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)隱患排查工作中屢有檢出。

硝基呋喃類藥物在生物體內(nèi)代謝迅速，很難檢測(cè)到原藥，因此標(biāo)準(zhǔn)方法都是對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，表1中列出了當(dāng)前適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行測(cè)定，其中農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006是中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的推薦方法，該方法的適用范圍廣、定量準(zhǔn)確、靈敏度高，是常用的檢測(cè)方法。

表1 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)

2、孔雀石綠檢測(cè)方法

孔雀石綠（malachite green, MG）作為一種三苯甲烷類染料，曾廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的驅(qū)蟲劑和殺菌劑，以防治魚類水霉病、鰓霉病、及小瓜蟲病等，是一類抗菌效力較強(qiáng)的藥用染料。然而，MG不僅在生物體內(nèi)有明顯蓄積現(xiàn)象，且迅速被代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)。在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，具有潛在的“三致”作用，因此包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都禁止其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。但是由于MG抗菌效果較好，價(jià)格低廉且無有效替代藥物等原因，在近幾年的監(jiān)控工作中發(fā)現(xiàn)MG仍在個(gè)別水產(chǎn)品種的養(yǎng)殖中違規(guī)使用。

表2是水產(chǎn)品中MG殘留測(cè)定常用的方法標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 19857—2005 (第一法）和GB/T 20361—2006的檢測(cè)結(jié)果相近，差異不顯著，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況自行選擇。但是與液相色譜法（LC）相比，LC-MS/MS前處理操作相對(duì)簡(jiǎn)單，定性方式更準(zhǔn)確，是進(jìn)行陽性樣品確證的必要方法，也是農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的首選方法。

表2 水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法

3、 氯霉素檢測(cè)方法

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是1947年首次從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取而得到的抗生素，具有廣譜抗菌作用，對(duì)多數(shù)G+、G-菌均有效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能有效防治爛鰓、赤皮病。CAP對(duì)人類的毒性較大，可抑制骨髓造血機(jī)能、造成過敏反應(yīng)，引起不可逆的再生性障礙貧血等。

美國(guó)、日本、韓國(guó)和歐盟等國(guó)家和地區(qū)均已禁止在食用性動(dòng)物中使用氯霉素，并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出。中國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定CAP為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出［6］。目前，CAP是中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的對(duì)象之一，其抑菌效果優(yōu)于其替代藥物，近年來在大宗水產(chǎn)品中的檢出率不高，但是帶入途徑復(fù)雜，仍是目前監(jiān)控的重點(diǎn)。

水產(chǎn)品中CAP殘留量的測(cè)定方法很多，包括酶標(biāo)法、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和LC-MS/MS等（表3）。其中酶標(biāo)法用于CAP的快速篩查測(cè)定，氣相色譜法可以用于CAP的準(zhǔn)確定量測(cè)定， LC-MS/MS和GC-MS法均可以作為CAP殘留的確證方法，在對(duì)陽性樣品的測(cè)定中，可以互為補(bǔ)充。

表3 水產(chǎn)品中氯霉素殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法

4、磺胺類

磺胺類藥物（sulfonamides, SAs）是對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于治療魚、蝦、蟹、鱉等動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，防治鯉的赤鰭病，香魚、虹鱒等的弧菌病等。由于SAs在生物體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，蓄積濃度超過一定值會(huì)對(duì)人體健康造成危害，導(dǎo)致很多細(xì)菌對(duì)SAs產(chǎn)生抗藥性［1］。

因此，許多國(guó)家都對(duì)SAs的使用限量進(jìn)行了規(guī)定，歐盟規(guī)定肉類食品中磺胺類藥物的最高殘留限量(MRL)為：?jiǎn)我籗As藥物≤25 μg/kg，SAs總量≤100 μg/kg；日本肯定列表規(guī)定動(dòng)物源性食品中單一SAs0.01~0.1 mg/kg，其中水產(chǎn)品為0.1 mg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)與中國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中均規(guī)定動(dòng)物組織中SAs藥物的MRL為100 μg/kg。

表4是水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，其中農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007和農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008是常用的檢測(cè)方法，農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007前處理繁瑣，回收率稍低，靈敏度基本能夠滿足限量要求；農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，可以用于磺胺類藥物的陽性確證。

表4 水產(chǎn)品中磺胺類殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法

二、水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證

    能力驗(yàn)證(proficiencytesting)也稱能力驗(yàn)證計(jì)劃，是通過實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的比對(duì)來判定實(shí)驗(yàn)室能力的合格評(píng)定活動(dòng)。近年來，農(nóng)業(yè)部組織開展了水產(chǎn)品中藥物殘留、重金屬及貝類毒素等3大方面檢測(cè)能力驗(yàn)證，涉及的能力驗(yàn)證考核參數(shù)包括氯霉素、孔雀石綠、鎘、鉛、麻痹性貝類毒素等20多項(xiàng)，有力地促進(jìn)了質(zhì)檢機(jī)構(gòu)的運(yùn)行和管理，提升了檢測(cè)人員的技術(shù)水平。

目前，獸藥殘留測(cè)定是進(jìn)行水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的主要手段，氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃等禁用藥物是藥物殘留監(jiān)控的重點(diǎn)，為了確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺類和喹諾酮類等限用藥物也早已納入監(jiān)控工作。但是由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的檢驗(yàn)?zāi)芰α驾积R，有時(shí)會(huì)對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性存在質(zhì)疑，影響了監(jiān)控工作的權(quán)威性，因此監(jiān)管部門將能力驗(yàn)證作為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室能力水平的一個(gè)主要的方式。

能力驗(yàn)證（proficiency testing）是通過實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則來判定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)。能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國(guó)際相互承認(rèn)協(xié)議（mutual recognition agreement, MRA）的必要條件之一，也是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自我評(píng)價(jià)的手段［2］。中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品能力驗(yàn)證考核始于2003年，雖然起步較晚，但是實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的方法標(biāo)準(zhǔn)均參考國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)制定，10多年來技術(shù)能力取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。能力驗(yàn)證在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的覆蓋率逐年增加，監(jiān)管部門通過組織能力驗(yàn)證，可以了解實(shí)驗(yàn)室是否有能力勝任所從事的監(jiān)控工作；實(shí)驗(yàn)室通過參加能力驗(yàn)證，了解自身能力，將其作為內(nèi)部質(zhì)量控制的補(bǔ)充措施，滿足持續(xù)改進(jìn)的要求。

根據(jù)能力驗(yàn)證活動(dòng)的要求，選擇正確的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，掌握檢測(cè)方法的操作要領(lǐng)和關(guān)鍵點(diǎn)，減少方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響是確保順利通過能力驗(yàn)證工作的關(guān)鍵。在此基礎(chǔ)上，還建議采取做好準(zhǔn)備工作，提高檢測(cè)能力，保證質(zhì)量控制措施到位，以及對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正確的修約等如下保障措施，減少不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。

對(duì)做好水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)能力驗(yàn)證工作，特提出以下建議：

1、提前練習(xí)

按規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序或作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行操作，熟練掌握方法的前處理過程，并能重現(xiàn)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液核查

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求重新配置標(biāo)準(zhǔn)貯備液或購(gòu)置有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，并與在用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行核對(duì)，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液的有效性。

3、 考核樣品的處理

檢查編號(hào)是否準(zhǔn)確，包裝是否完整、無破損，按照通知要求進(jìn)行保存。嚴(yán)禁用微波等加熱方式對(duì)樣品解凍，應(yīng)在室溫下自然解凍后再進(jìn)行前處理。樣品前處理過程中，應(yīng)盡量避光操作。

4、做好質(zhì)量控制

質(zhì)量控制中應(yīng)包括空白實(shí)驗(yàn)(包括試劑空白和對(duì)應(yīng)的基質(zhì)空白)和控制樣品（檢出限加標(biāo)、3~10倍檢出限加標(biāo)），與考核樣品同時(shí)測(cè)定。空白實(shí)驗(yàn)可確?？瞻字翟诳刂葡迌?nèi)，避免測(cè)試過程中的污染和空白基質(zhì)中的干擾?？刂茦悠返挠行钥纱_保測(cè)試結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。

5、 檢測(cè)結(jié)果的判斷

在進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果計(jì)算時(shí)，首先應(yīng)考察校準(zhǔn)曲線是否滿足要求，其次是平行樣的測(cè)定結(jié)果是否在相對(duì)偏差范圍內(nèi)，然后是質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和靈敏度是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，還要進(jìn)行不確定度的計(jì)算。對(duì)于偏差較大的數(shù)據(jù)，可以采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行測(cè)算，如平均值的置信區(qū)間等。

（內(nèi)容參考食典報(bào)）